Regulasi Promoter Thymidine Kinase oleh Sp1 Dan NF-kB: Potensi Misinterpretasi Hasil Uji Lusiferase
DOI:
https://doi.org/10.24252/jb.v13i2.56431Kata Kunci:
lusiferase, pRL-Null, pRL-TK, RelA NF-kB, Sp1, TK promoterAbstrak
Uji lusiferase banyak digunakan di laboratorium biologi molekuler untuk menentukan efek faktor transkripsi terhadap ekspresi gen target. Uji lusiferase umum melibatkan ko-transfeksi promotor gen target dan plasmid kontrol (yang bertujuan untuk normalisasi efisiensi transfeksi). Plasmid yang mengandung lusiferase Renilla (Rluc) merupakan plasmid kontrol yang paling populer karena tidak diekspresikan oleh sel mamalia sehingga mencegah bias hasil uji. Plasmid komersial kontrol pRL-TK (GenBank AF025846; Promega) mengandung promotor herpes simplex virus timidin kinase. Plasmid kontrol yang baik adalah ekspresinya tidak dipengaruhi oleh plasmid ko-transfeksi atau perlakuan eksperimental. Namun, hasil penelitian ini menunjukkan bahwa ko-transfeksi Sp1 atau RelA NF-kB (250 ng) dengan pRL-TK (25 ng) dapat meningkatkan ekspresi Rluc hingga 95 dan 50 kali lipat. Analisis sekuens menunjukkan promotor ini memiliki 14 Sp1-binding site dan 1 RelA-binding site. Hal ini mengindikasikan bahwa penggunaan pRL-TK atau plasmid kontrol lain yang mengandung promotor TK dapat menyebabkan misintepretasi dan menghasilkan false negative result. Selain itu, ko-transfeksi Sp1 atau RelA NF-kB (250 ng) dan pRL-Null (25 ng) yang tidak mengandung promotor TK juga meningkatkan ekspresi Rluc hingga 10 dan 5 kali lipat. Dengan meningkatkan jumlah Sp1 dan RelA NF-kB (0,5 µg) dan menurunkan pRL-Null (12,5 ng) yang di transfeksi, aktivasi pRL-null oleh kedua faktor transkripsi ini dapat diminimalisir. Dapat disimpulkan bahwa penggunaan plasmid yang mengandung promotor TK harus dihindari ketika mempelajari aktivitas transkripsi Sp1 dan RelA NF-kB.
Unduhan
Referensi
Branchini, B. R., Southworth, T. L., Fontaine, D. M., Kohrt, D., Florentine, C. M., & Grossel, M. J. (2018). A Firefly Luciferase Dual Color Bioluminescence Reporter Assay Using Two Substrates To Simultaneously Monitor Two Gene Expression Events. Scientific Reports, 8(1), 5990. https://doi.org/10.1038/s41598-018-24278-2
Chen, Y.-T., Tsai, H.-P., Wu, C.-C., Chen, C.-Y., Chai, C.-Y., & Kwan, A.-L. (2019). High-level Sp1 is Associated with Proliferation, Invasion, and Poor Prognosis in Astrocytoma. Pathology & Oncology Research, 25(3), 1003–1013. https://doi.org/10.1007/s12253-018-0422-8
Dupuis-Maurin, V., Brinza, L., Baguet, J., Plantamura, E., Schicklin, S., Chambion, S., Macari, C., Tomkowiak, M., Deniaud, E., Leverrier, Y., Marvel, J., & Michallet, M.-C. (2015). Overexpression of the Transcription Factor Sp1 Activates the OAS-RNAse L-RIG-I Pathway. PLOS ONE, 10(3), e0118551. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0118551
Gilmour, J., O’Connor, L., Middleton, C. P., Keane, P., Gillemans, N., Cazier, J.-B., Philipsen, S., & Bonifer, C. (2019). Robust hematopoietic specification requires the ubiquitous Sp1 and Sp3 transcription factors. Epigenetics & Chromatin, 12(1), 33. https://doi.org/10.1186/s13072-019-0282-9
Unduhan
Diterbitkan
Cara Mengutip
Terbitan
Bagian
Lisensi
Hak Cipta (c) 2025 Ferbian Siswanto
Artikel ini berlisensiCreative Commons Attribution-ShareAlike 4.0 International License.
Authors who publish with Jurnal Biotek agree to the following terms: Authors retain the copyright and grant Universitas Islam Negeri Alauddin Makassar right of first publication with the work simultaneously licensed under a Creative Commons Attribution License (CC BY-SA 4.0) that allows others to share (copy and redistribute the material in any medium or format) and adapt (remix, transform, and build upon the material) the work for any purpose, even commercially with an acknowledgement of the work's authorship and initial publication in Universitas Islam Negeri Alauddin Makassar. Authors are able to enter into separate, additional contractual arrangements for the non-exclusive distribution of the journal's published version of the work (e.g., post it to an institutional repository or publish it in a book), with an acknowledgement of its initial publication in Universitas Islam Negeri Alauddin Makassar. Authors are permitted and encouraged to post their work online (e.g., in institutional repositories or on their website) prior to and during the submission process, as it can lead to productive exchanges, as well as earlier and greater citation of published work (See The Effect of Open Access).
This work is licensed under a Creative Commons Attribution-ShareAlike 4.0 International License.
